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【检验方法】(食品中大肠菌群的检测方法见 GB4789.3—2016)
污水样品应至少取200mL,使用前应充分混匀。
根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确定污水样品接种量。粪大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10mL、1mL、0.1mL(1:10稀释的1mL)。粪大肠菌群数较多时接种量为1mL、0.1mL(1:10稀释的1mL)、0.01mL(1:100稀释的1mL) 或 0.1mL(1:10稀释的1mL)、0.01mL(1:100稀释的1mL)、0.001mL(1:1000稀释的1mL) 等。
接种量少于1mL时,水样应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量为0.1mL、0.01mL
时,取稀释比分别为1:10、1:100。其它接种量的稀释比依此类推。
1:10 稀释样品的制作方法为:吸取1mL水样,注入到盛有9mL灭菌水的试管中,混匀,
制成1:10 稀释样品。因此,取1mL1:10稀释样品,等于取0.1mL污水样品。其它稀释比的
稀释样品同法制作。
注1:若样品为经过氯消毒的污水,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
污泥样品应至少取200g,使用前应充分混匀。
根据预计的污泥样品中粪大肠菌群数量确定污泥样品接种量。粪大肠菌群数量相对较
少的污泥样品接种量一般为0.1g、0.01g、0.001g。粪大肠菌群数量较多时接种量为0.01g、
0.001g、0.0001g 或0.001g、0.0001g、0.00001g 等。
污泥样品应制成稀释样品后供发酵试验使用。接种量0.1g、0.01g、0.001g 的稀释样
品制作方法如下:取20g 污泥样品,加入到三角烧瓶中,加灭菌水使成200mL,混匀,制成1:10 稀释样品。吸取1:10 稀释样品1mL,注入到盛有9mL灭菌水的试管中,混匀,制成1:100稀释样品。按同法制成1:1000 稀释样品。接种1mL1:10、1:100、1:1000 稀释样品等于接种0.1g、0.01g、0.001g 污泥样品。
注2:若样品为经过氯消毒的污泥,应在采样后立即用5%硫代硫酸钠溶液充分中和余氯。
将样品接种于装有乳糖胆盐培养液的试管(内有小倒管)中,44℃培养24h。样品接种
体积以及管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积根据以下条件确定:
样品为污水时,取三个接种量、每个接种量的样品分别接种于5个试管内,共需15个试管。试管内乳糖胆盐培养液的浓度与体积应根据接种量确定。若接种量为10mL,吸取10mL样品接种于装有5mL的 三倍浓度乳糖胆盐培养液的试管内;若接种量为1mL时,吸取1mL 样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内;若接种量少于1mL时,吸取1mL的稀释样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。
样品为污泥时,取三个接种量、每个接种量的稀释样品分别接种于3 个试管内,共需9个试管。 9个试管中,各装有10mL 乳糖胆盐培养液。各个试管接种稀释样品体积均为1mL。
大肠杆菌分解乳糖产酸时培养液变色、产气时小倒管内出现气泡。经24h 培养后,将产酸的试管内培养液分别划线接种于伊红美蓝(EMB) 培养基上。置于37℃培养箱中,培养18~24h。
挑选可疑粪大肠菌群菌落,进行革兰氏染色和镜检。可疑菌落有:1)深紫黑色,具有
金属光泽的菌落;2)紫黑色,不带或略带金屑光泽的菌落;3)淡紫红色,中心色较深的菌落。
上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢杆菌,则挑取上述典型菌落1~3 个接种于
盛有5mL 乳糖蛋白胨培养液倒管和倒管的试管内,置于44℃培养箱中培养24h。产酸产气试管为粪大肠菌群阳性管。
根据证实有粪大肠菌群存在的阳性管数,查表A1(见GB18466-2005的A1表)或A2 (见GB18466-2005的A2表)可得100mL 污水或1g 污泥中粪大肠菌群MPN 值。
由于GB18466-2005中表A1 和表A2 是按一定的三个10 倍浓度差接种量设计的(污水接种量为10mL、1mL和0.1mL,污泥接种量为0.1g、0.01g 和0.001g),当采用其他三个10倍浓度差接种量时,需要修正表内MPN 值,具体方法如下:
表内所列污水(污泥)大接种量增加10倍时表内MPN值相应降低10倍;污水(污泥)大接种量减少10倍时表内MPN值相应增加10倍。如污水接种量改为1mL、0.1mL和0.01mL时,A1 表内MPN值相应增加10倍。其它的三个10倍浓度差接种量的MPN值相应类推。
由于A1表内MPN值的单位为每100mL污水样品中MPN值,而污水以1L为报告单位,因此需将查A1表得到的MPN值乘上10,换算成1L污水样品中的MPN值。
根据粪大肠菌群MPN值,报告1L污水或1g污泥样品中粪大肠菌群MPN 值。
注3:乳糖胆盐培养液和乳糖蛋白胨培养液的试管内有小倒管,如果在使用前小倒管内有空气,请将试管倒置轻轻摇动,使小倒管内的空气排出后方可使用。
注4:食品中大肠菌群的检测方法见 GB4789.3—2016
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